 來源：腐敗產品之鋁箔包保久乳來自A廠，調味乳來自B廠。

 

 腐敗包內容物直接鏡檢

 

　　腐敗包經搖動混合后，以75% 酒精擦拭包裝盒頂，在無菌操作箱中以U. V. 照射表面，按鄭等（1997）之方法，將異常品取內容物1 ml，在5 ml無菌水中稀釋，于位相差顯微鏡（OPTIPHOT-2, Nikon）觀察腐敗菌之形態，并記錄腐敗產品之特性，如pH值、口味。

 

 腐敗產品之取樣培養與微生物分離

 

　　以無菌操作法使用無菌吸管吸取0. 2 ml之內容物至nutrient agar（Difco）表面涂抹，在35 ℃培養三天，由nutrient agar之平板上挑出五個菌落，于位相差顯微鏡下觀察是否與直接鏡檢腐敗內容物具有相同細胞形態與菌相。若具運動性，革蘭氏陽性，并產生孢子，符合這些條件之菌落，再以API（Analytab Products Inc. ）公司之API 50CHB和API 20E快速檢測套組（Logan and Berkeley, 1984），在35 ℃，48小時培養后，觀察呈色反應，將結果輸入ATB（Automatic Tests in Bacteriology）自動判讀系統，鑑定其種名。

 

　

 

二. 孢子懸浮液之制備

 

 一般處理：由腐敗保久乳分離鑑定后之菌株B. cereus TP-5以nutrient broth培養隔夜，取0.1 ml涂抹于含10 ppm MnCl2?4H2O之nutrient agar的平板內（Kim and Naylor, 1966），于35 ℃ 培養4天，在位相差顯微鏡下觀察，孢子完全成熟后再加入無菌水將培養基表面的孢子用涂抹棒將其刮起放入試管中，再用無菌水清洗三次（8000X，離心10分鐘），做成孢子懸浮液，然后于85 ℃ 熱水中加熱12分鐘，以殺死營養細胞，并于4 ℃ 冷藏之（Rajkowski and Mikolajcik, 1987）。

 

　

 

 特殊處理：按Gaze et al.（1990）增加細菌孢子之耐熱性之方法，將分離株B. cereus TP-5涂抹于產孢之培養基（7.5 g之nutrient agar，含10 ppm MnCl2?4H2O, 0.8 ml之100 ppm（w/v）之CaCl2 和2.2 M sucrose，溶于300 ml蒸餾水），40 ℃ 培養5天，在位相差顯微鏡下觀察，孢子完全成熟后，用2.2 M sucrose溶液收集，做成孢子懸浮液，然后于85 ℃ 熱水中加熱12分鐘，迅速冷卻后，儲存于4 ℃ 備用。

 

　

 

三. 孢子耐性測試

 

　　按Russell（1982）之方法將前項已收集好的孢子以0. 067 M磷酸緩衝溶液（phosphate buffer solution）稀釋，使每ml約含106個孢子，各裝2 ml孢子懸浮液于TDT試管（thermal death time tube），并以火焰封管后，置于恒溫油槽中（NESLab, Exacal, EX-251 HT, USA），同一個溫度五種不同的加熱時間，各取6支試管測試其100 ℃、105 ℃ 和110 ℃ 之孢子耐熱性，加熱完畢后立即放入冰浴槽中冷卻，再以鉆石玻璃刀將TDT試管開口打破，孢子懸浮液倒入殺菌過的nutrient broth，并按Ashton（1971）之方法添加0.1% soluble starch（Difco）以增加受傷孢子之回收，在35 ℃ 培養二天，觀察試管中微生物有無生長。D值計算根據Stumbo ( 1973a ) 之方法如下：

 

D＝ t /（log a－log b）

 

t：加熱時間

 

a：最初細菌孢子數

 

b：殘存細菌孢子數

 

　　6支試管全部生長時，則視為每支試管至少有一個以上孢子未被殺死；只有部份生長，部份未生長時，視為有生長的為各由一個殘存孢子生長所致，D值為殺菌孢子數90% 所需之時間，Z值為細菌孢子之D值降低90% 時所需溫度之差距，亦即細菌孢子死滅速度D值之溫度系數。

 

　

 

四. UHT對于B. cereus 孢子之殺菌效果

 

　　將B. cereus TP-5之孢子懸浮液接種至還原乳300 L，使每ml之還原乳中含105～106個之孢子，經由板式熱交換機（Sterilab, Vtis, Alfa Laval, Sweden）之加熱135 ℃ 或140 ℃，4秒后，以TBA 3充填機（Tetra Pak, Sweden）包裝后產品經37 ℃ 保溫14天后，檢測其包裝外觀和內容物所產生之腐敗現象。

 

　

 

五. CIP清洗與蒸汽預殺菌對于B. cereus孢子之殺菌

 

　　將B. cereus TP-5之孢子懸浮液加入300 L之還原乳，使還原乳之孢子數105 spores/ml，于板式熱交換、無菌管路和無菌桶中循環1小時后再以CIP清洗，以熱水、堿液、熱水、酸液、熱水之順序清洗，先以熱水沖洗5分鐘，再以1.5% NaOH堿液，80 ℃ 清洗30分鐘，熱水沖洗后再以1% HNO3，65 ℃ 清洗25分鐘，最后以50 ℃ 熱水沖洗；隔天生產前，再使用蒸汽殺菌管路，蒸汽維持在121℃，30分鐘。蒸汽殺菌后，將無菌桶之閥組與板式熱交換機之板片拆卸，以棉花棒涂抹法，按Sveum et al. ( 1992 ) 之方法取板片上有乳垢之處，依CNS 12540仙人掌桿菌之MPN檢測法檢測，正反應之試管按Holbrook and Anderson（1980）之方法，涂抹至PEMBA（polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar）（bactopeptone, 0.1%; D-mannitol 1%; MgSO4．7H2O 0.01%; NaCl 0.2%; Na2HPO4 0.25%; KH2PO4 0. 025%; bromothymol blue 0. 012%; agar 1.5 %; pH 7. 2±0. 2）。polymyxin最終濃度為100 unit/ml，培養在35 ℃，48小時，典型菌落為圓鋸齒狀，綠色菌落之透明外環。由PEMBA之每個平板上挑出三個典型菌落，并在位相差顯微鏡下觀察是否是產孢桿菌，具運動性，并且好氣和厭氣下都能生長，符合這些條件的菌落，再以API 50CHB和API 20E快速檢測套組，在35 ℃，48小時培養后觀察呈色反應，將結果輸入ATB自動判讀系統，鑑定種名，以確定其是否為B. cereus。